A triagem genética avançada usando escala de fundo de olho identifica um papel essencial para Lipe na homeostase da retina murina

Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 533 (2023) Cite este artigo

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A micróglia desempenha um papel na patogênese de muitas doenças da retina. As manchas de fundo em camundongos geralmente se correlacionam com o acúmulo de micróglia sub-retiniana ativada. Aqui, usamos uma escala semiquantitativa de pontuação de ponto de fundo em combinação com um pipeline genético avançado de última geração e imparcial para identificar associações causais entre mutações induzidas quimicamente e fenótipos de ponto de fundo. Entre várias associações, focamos em uma mutação missense em Lipe ligada a um aumento de manchas amarelas de fundo em camundongos C57BL/6J. Descobriu-se que camundongos Lipe-/- gerados usando a tecnologia CRISPR-Cas9 desenvolvem acúmulo de micróglia sub-retiniana, uma degeneração da retina com diminuição da função visual e um perfil lipídico anormal da retina. Estabelecemos um papel indispensável do Lipe na homeostase lipídica da retina/RPE e na saúde da retina. Novos estudos usando este novo modelo terão como objetivo determinar como a desregulação lipídica resulta na ativação da micróglia sub-retiniana e se essa micróglia também desempenha um papel na degeneração retiniana subsequente.

Um grande número de estudos mostrou associação entre a microglia retiniana ativada e doenças como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), distrofias retinianas e retinopatia diabética1,2,3,4,5,6,7,8,9. Ainda se discute se essas células são deletérias (por promover inflamação)9,10,11,12,13,14,15 ou homeostáticas (por remover detritos)16. De fato, é possível que em diferentes circunstâncias eles possam ser ambos7,10,17,18,19,20. Propomos que a identificação de genes que modulam o acúmulo da microglia sub-retiniana nos ajudará a identificar vias essenciais para a homeostase da retina. Além disso, a caracterização cuidadosa dos modelos de camundongos resultantes também pode lançar alguma luz sobre os mecanismos que regulam a vigilância imunológica, o tráfego celular e a neuroinflamação na retina. Com esses objetivos em mente, aplicamos aqui uma tela de escala de fundo de olho ao nosso pipeline avançado de genética avançada21,22, cuja maior vantagem em comparação com outros protocolos avançados de genética23,24,25,26,27,28,29 , é o fato de que todos os camundongos rastreados são camundongos G3 que foram pré-genotipados em todos os loci mutantes, permitindo a determinação imediata de mutações causais22. Isso nos dá a oportunidade de buscar associações gene-fenótipo que outros podem ignorar. Nas telas genéticas avançadas tradicionais, há um grande esforço envolvido na busca de quaisquer "acertos" em potencial, porque muitos deles utilizam outcross/intercross para uma cepa de mapeamento em combinação com sequenciamento de exome para identificar retrospectivamente mutações causais, um processo que é demorado. consumindo. Isso desencoraja a busca de quaisquer associações que não levem a uma patologia grave.

Embora a composição exata dos pontos sub-retinianos brancos/amarelos vistos em fotos de fundo de camundongos em vários modelos não seja totalmente certa, nós e outros mostramos anteriormente que eles se correlacionam bem com a microglia sub-retiniana Iba1+10,30,31,32. Desenvolvemos uma escala33, para realizar análises semiquantitativas rápidas e reprodutíveis dessas manchas. Aqui, usamos essa escala de ponto de fundo para rastrear perto de 6.000 camundongos G3 para mutações que alteraram as pontuações de ponto de fundo em comparação com camundongos de tipo selvagem. Identificamos vários genes que, quando mutados, levaram ao acúmulo de fundus spot. Seis desses genes já são conhecidos por causar patologia retiniana (Tabela Suplementar S1), fornecendo prova de princípio. A partir das associações gene-fenótipo, decidimos perseguir o gene Lipe, tanto porque sua mutação levou a um forte fenótipo de acúmulo de fundus spot quanto porque a escala fundus spot foi o único parâmetro de triagem que nos permitiu identificá-lo.

Neste trabalho, também demonstramos que uma linhagem de camundongo Lipe−/− gerada por CRISPR reproduz nossas descobertas de acúmulo extensivo de manchas de fundo em fotos da retina. Mostramos que eles desenvolvem acúmulo de micróglia sub-retiniana e uma degeneração retiniana. Em seguida, caracterizamos esses camundongos com ênfase na imagem da retina, anatomia e ultraestrutura da retina, hibridização in situ, eletrofisiologia e imuno-histoquímica. Finalmente, usando cromatografia líquida de ultra alta performance com espectrometria de massa, demonstramos que os camundongos Lipe−/− exibem uma anomalia no metabolismo lipídico na retina e RPE.