Identificação de pequenas moléculas capazes de aumentar a fusão da membrana viral

Virology Journal volume 20, Número do artigo: 99 (2023) Citar este artigo

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Várias abordagens foram desenvolvidas para analisar a entrada de vírus altamente patogênicos. Neste estudo, relatamos a implementação de um ensaio de Complementação Multicelular Bimolecular (BiMuC) para monitorar com segurança e eficiência a fusão de membrana mediada por SARS-CoV-2 S sem a necessidade de equipamentos baseados em microscopia. Usando o BiMuC, examinamos uma biblioteca de medicamentos aprovados e identificamos compostos que aumentam a fusão da membrana celular mediada pela proteína S. Entre eles, o etinilestradiol promove o crescimento do vírus SARS-CoV-2 e Influenza A in vitro. Nossas descobertas demonstram o potencial do BiMuC para identificar pequenas moléculas que modulam o ciclo de vida de vírus envelopados, incluindo o SARS-CoV-2.

A nova síndrome respiratória aguda grave coronavírus-2 (SARS-CoV-2) [1, 2] causou a doença pandêmica conhecida como doença de coronavírus 2019 (COVID-19). Esta doença teve e continua a ter um tremendo impacto em nossos sistemas de saúde e na economia global. Consequentemente, esforços extraordinários foram feitos para desenvolver medidas profiláticas e terapêuticas para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à doença de COVID-19.

A membrana celular é a primeira barreira que o vírus encontra ao infectar uma nova célula. Em algum momento durante a entrada, os vírus envelopados devem fundir as membranas celulares e virais. No caso do SARS-CoV-2, a proteína spike altamente glicosilada (S) é responsável por entrar nas células hospedeiras [3]. A proteína S, uma proteína de fusão trimérica classe I [4], é traduzida em uma forma não ativa (S0). A ativação proteolítica de S0 por proteases hospedeiras (isto é, TMPRSS2) produz a proteína S madura de pré-fusão incorporada nos virions [5]. O processo infeccioso começa com a ligação da proteína S à enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) na superfície celular [2, 6]. A ligação ao ACE2 desencadeia uma mudança conformacional, resultando na exposição do peptídeo de fusão da proteína S, que irá interagir com a membrana do hospedeiro e iniciar a fusão das membranas viral e celular. Facilitar qualquer uma das várias etapas desse processo complexo aceleraria e aumentaria a produção viral, acelerando o desenvolvimento de vacinas tradicionais, reduzindo os custos de produção e aumentando o rendimento da fabricação [7].

Várias abordagens foram desenvolvidas para analisar com segurança a entrada viral, incluindo ensaios baseados em pseudotipos de vírus, ensaios baseados em partículas semelhantes a vírus, ensaios bioquímicos ou ensaios de fusão célula-célula. A identificação do sincício, devido à expressão da maquinaria de fusão viral e do receptor correspondente do hospedeiro na superfície celular, tem sido tradicionalmente feita por microscopia. No entanto, metodologias baseadas em microscópio dificultam a quantificação do processo de fusão e a implementação de métodos de alto rendimento para identificação de pequenas moléculas.

Para estudar o processo de fusão de membrana mediada por SARS-CoV-2 S, decidimos adaptar o ensaio de Complementação Multicelular Bimolecular (BiMuC) recentemente desenvolvido [8]. Com base nas propriedades de complementação bimolecular de uma proteína repórter fluorescente, este ensaio facilita a identificação e quantificação de eventos de fusão célula-célula induzidos por vírus sem a ajuda de equipamento baseado em microscópio. Depois de acomodar o BiMuC para o estudo do SARS-CoV-2, montamos uma tela para pequenas moléculas capazes de modular o processo de fusão da membrana mediado pela proteína S. Nós rastreamos 1280 pequenas moléculas, usando este ensaio, e identificamos que o etinilestradiol aumenta a fusão da membrana celular mediada pela proteína S. Como resultado, o etinilestradiol aumenta o crescimento de SARS-CoV-2 in vitro. Além disso, o efeito na fusão da membrana mediada por vírus não se restringe ao SARS-CoV-2. Demonstramos que o etinilestradiol pode aumentar o crescimento do vírus Influenza A e a fusão da membrana do vírus Nipah. Nossos resultados mostram que o BiMuC pode ser implementado para monitorar o processo de fusão da membrana SARS-CoV-2 e identificar pequenas moléculas que perturbam esse processo.

1.5. Hits were confirmed in secondary screening. This time cells included the pRL-Renilla. The luminescence was measured using the Renilla Luciferase Assay kit from Sigma following the manufacturer protocol on 96-well white cell-culture plates. This measure facilitates the elimination of those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. To discard the hits that had fluorescent properties similar to VFP, cells were seeded in black 96-well plates and treated with the compounds under the same conditions as described above. In this case, fluorescence was measured as before (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). In all assays, [DMSO] was kept at ≤ 1%. Statistical analysis was done with Libre Office Calc./p> 1.5 (Table S1). Hits were re-tested using the same experimental conditions and selection criteria. Only the compounds capable of enhancing viral fusion in both rounds were considered (Fig. 2B). Additionally, we measured the luminescence from the Renilla luciferase and eliminated those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. We also tested the fluorescence properties of the remaining hits and discarded those compounds emitting near 530 nm (Fig. 2B)./p>