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Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 7741 (2022) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

A qualidade inadequada da água potável está entre as principais causas de mortalidade evitável, predominantemente em crianças pequenas. Identificar fontes de água contaminada continua sendo um desafio significativo, especialmente onde os recursos são limitados. Os métodos atuais para medir Escherichia coli (E. coli), o indicador preferido da OMS para medir a contaminação fecal da água, envolvem incubação durante a noite e requerem treinamento especializado. Em 2016, o UNICEF lançou um Perfil de Produto Alvo (TPP) para incentivar inovações de produtos para detectar baixos níveis de E. coli viáveis em amostras de água no campo em menos de 6 h. Impulsionados por este desafio, desenvolvemos um ensaio baseado em fagos para detectar e semi-quantificar E. coli. Formulamos um coquetel de fagos contendo um total de 8 fagos selecionados contra uma extensa biblioteca de cepas bacterianas e recombinados com o sensível NanoLuc luciferase repórter. O ensaio foi otimizado para ser processado em um chip microfluídico projetado internamente e foi testado em amostras de esgoto de origem local e em fontes de água potável em Nairóbi, no Quênia. Com este ensaio, combinado com a plataforma de chip microfluídico, propomos uma solução automatizada completa para detectar e semi-quantificar E. coli em menos de 10 MPN/100 mL em 5,5 h por pessoal minimamente treinado.

A importância do acesso sustentável à água potável continua a ser fundamental para reduzir a pobreza e melhorar a saúde e o bem-estar da população mundial. Embora tenha havido progresso em direção aos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável e seu foco no aumento do acesso à água potável (ODS 6)1, a qualidade de muitos suprimentos de água permanece incerta. As doenças diarreicas, principalmente devido a alimentos e água contaminados, continuam a ser a segunda principal causa de morte em crianças menores de cinco anos, causando 8% de todas as mortes globais, com 80% das mortes ocorrendo no sul da Ásia e na região subsaariana África2. Inspecionar a qualidade da água quanto à presença de patógenos causadores de diarreia é vital para o bem-estar de milhões de pessoas.

Um dos riscos microbianos mais significativos está associado à ingestão de água contaminada com fezes de humanos ou animais3. Embora a maioria dos coliformes seja inofensiva para os seres humanos, eles são utilizados em testes para indicar a presença potencial de patógenos perigosos. A E. coli, em particular, tem muitas características ideais de um organismo indicador, pois é derivada quase exclusivamente de fezes humanas e animais e inclui algumas cepas patogênicas (por exemplo, O157:H7)4. Embora o uso de indicadores fecais (coliformes, coliformes termotolerantes, E. coli) tenha sido criticado, uma vez que sua presença apenas implica que o risco de presença de patógenos aumentou, o monitoramento de centenas de patógenos transmitidos pela água conhecidos permanece impraticável e é extremamente desafiador fazer rapidamente e a baixo custo4. Além disso, informações sobre a quantidade do indicador fecal são essenciais, pois o risco de adquirir uma infecção de veiculação hídrica aumenta com o nível de contaminação.

Limites bacterianos aceitáveis foram definidos pela OMS3, entre outros, e afirma que toda a água destinada ao consumo não deve conter nenhuma E. coli detectável ou bactéria coliforme termotolerante em qualquer amostra de 100 mL, sendo E. coli agora o indicador preferencial. Os métodos mais utilizados para detecção de coliformes em amostras de água são filtração por membrana, fermentação em tubos múltiplos pelo método do Número Mais Provável (MPN) e testes de presença/ausência, como o teste de sulfeto de hidrogênio5. Embora esses métodos possam atingir uma sensibilidade de 1 UFC/100 mL entre US$ 0,5–7,5/teste, eles costumam ser trabalhosos, exigem treinamento de pessoal especializado, são difíceis de usar no campo e exigem longos períodos de incubação, geralmente durante a noite6. Nenhum teste pode detectar rapidamente baixos níveis de E. coli viável na água em menos de 8 h7.

109 PFU/mL) and low luminescence background that induce the expression of a high luminescence signal relatively fast (< 3 h) and that are stable at 4 °C. For example, reporter phage Phi7 and T7 have similar luminescence-based host ranges; however, T7 yielded a positive luminescence signal two hours faster and was selected over phage Phi7. The titer of phage T2 decreased by a couple of logs over the course of a few weeks during storage at 4 °C and was not pursued as a candidate for the cocktail. Similarly, the titer of phage T6 was found to decrease during centrifugation steps and was also deprioritized in favor of other phages with better stability during purification. Finally, phage Phi6 was removed early in the process due to poor purification efficiency resulting in high luminescence background levels./p> 1000) or in triplicate (MPN values < 1000) to generate a range of cell concentrations for testing (Fig. 5b)./p> 100./p> 100 E. coli MPN/100 mL (very high contamination). This calibration curve is dependent on the quality of the phage reagents (titer, purity) and would have to be determined for each phage cocktail production lot./p>

109 PFU/mL) were treated with sodium azide (0.05%) to create a storage phage stock solution. Finally, a phage cocktail solution was prepared by mixing stock solutions of eight phages in TSB (each at final concentration 1:80 from stock) and stored at 4 °C until ready to use. The phage titers were stable for at least 6 months./p> 108 PFU/mL) was added to appropriate wells (final well composition: TSB with 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 50 mM Tris–HCl pH 7.5). The plate was incubated for an additional 3 h, after which 100 µL of the culture was transferred to a white 96-well plate, mixed 1:1 with NanoGlo substrate, and incubated at room temperature for 3 min before reading using a plate reader (BioTek Synergy H1, 1 mm read height, 1 s integration)./p> 107 (250 µL). The chip was further incubated (37 °C, 3 h) to allow for phage infection. Vacuum was then applied to transfer the produced NanoLuc-CBM enzyme from the PVDF membrane to the nitrocellulose (NT) capture membrane. Finally, Nano-Glo substrate (75 µL) was added to the chamber below the NT membrane. Luminescence was read immediately, using a custom-built detection assembly with a photomultiplier tube (ET Enterprises, Ltd., Uxbridge, UK)22. The Aquasafe® WSL50 Pro membrane filtration kit (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, UK) was used to quantify CFU's within the river samples, and the Quanti-Tray/2000 system (IDEXX, Westbrook, ME) was used to determine MPN in sewage samples./p>