Construção de uma subunidade

Scientific Reports volume 6, Número do artigo: 19183 (2016) Citar este artigo

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As metalochaperonas são proteínas de ligação a metais projetadas para fornecer o metal apropriado a uma proteína alvo. O metal geralmente é transferido entre diferentes proteínas. Neste estudo, descobrimos que o metal foi transferido entre a mesma subunidade de uma nitrila hidratase mutante (NHase). Várias "proteínas ativadoras" medeiam o tráfico de íons metálicos para as NHases. Construímos NHases de fusão fundindo as subunidades β e α e/ou as "proteínas ativadoras" da NHase de Pseudomonas putida. A fusão NHases exibiu maior termoestabilidade e tolerância a altas concentrações do produto amida. O mecanismo de incorporação do cobalto mudou de um padrão de autotroca de subunidades para um padrão de chaperona molecular específico da apoproteína in vivo e um padrão de metalochaperona in vitro. Notavelmente, a transferência de cobalto ocorreu entre a mesma subunidade α no padrão de metalochaperona. Esses resultados não apenas demonstraram a superioridade das NHases do tipo fusão, mas também revelaram um padrão inovador de transferência de íons metálicos na biossíntese de metaloproteínas.

As metaloproteínas têm sido intensamente caracterizadas por décadas e mais de um terço de todas as proteínas são metaloproteínas1. As funções mediadas pelos íons metálicos nas proteínas incluem transferência de elétrons, transporte de oxigênio, regulação de genes e estabilização de estruturas2. Vários mecanismos gerais de biossíntese de metalocentro foram relatados em uma revisão3; um deles é a entrega de metalochaperona de um íon metálico ou moléculas contendo metal. As metalochaperonas são proteínas de ligação a metais projetadas para entregar o íon metálico apropriado ou moléculas contendo metal a uma proteína alvo. A proteína alvo e a metalochaperona geralmente são proteínas diferentes e a proteína alvo exibe especificidade de ligante e mais afinidade pelo íon metálico.

A nitrila hidratase (NHase, EC 4.2.1.84)4 é uma enzima que catalisa a hidratação de um amplo escopo de nitrilas nas amidas correspondentes5. A enzima é composta de subunidades α e β e contém um ferro não heme (Fe-NHase)6 ou um cobalto não corrina (Co-NHase)7,8. O tráfego de íons metálicos para as NHases é mediado pelas correspondentes "proteínas ativadoras"9. Os ativadores para Fe-NHases demonstraram atuar como metalochaperonas10, enquanto as "proteínas ativadoras" agem como "chaperonas de troca de subunidades próprias" para incorporação de cobalto na maioria das Co-NHases9,11,12.

A troca de auto-subunidades é uma das etapas de maturação pós-traducional da família Co-NHase11. A proteína ativadora existe como um complexo com a subunidade α da NHase e a incorporação do cobalto na NHase depende da troca da subunidade α entre a subunidade α livre de cobalto da NHase e a subunidade α contendo cobalto do complexo9. A troca de auto-subunidades é bastante diferente dos mecanismos gerais atualmente conhecidos de biossíntese de metalocentros9,11,13, que foram relatados em uma revisão por Kuchar e Hausinger3, como segue: (i) ligação reversível de íons metálicos; (ii) entrega de metalochaperona de um íon metálico ou cofator; (iii) modificação pós-translacional criando um sítio de ligação de metal; (iv) ligação sinérgica de um metal com outro componente; (v) síntese de cofatores contendo metais; (vi) incorporação de metais associada à transferência de elétrons; e (vii) necessidade de uma chaperona molecular específica de apoproteína e assim por diante14. A troca de auto-subunidades foi descoberta pela primeira vez na L-NHase de Rhodococcus rhodochrous J19 e, posteriormente, na H-NHase da mesma cepa11 e especula-se que ocorra em várias outras Co-NHases e uma enzima da família NHase, tiocianato hidrolase, que também contém um único centro de cobalto não corrina com dois ligantes de cisteína modificados pós-translacionalmente12,15. "Chaperonas de troca de subunidades próprias" exibem uma função de proteína surpreendente em contraste com metalochaperonas na biossíntese de metalocentro e chaperonas moleculares no enovelamento de proteínas9,11.