Membrana nanoporosa magnética eletrodepositada para alta

Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 1358 (2022) Citar este artigo

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Nanobeads superparamagnéticos oferecem várias vantagens sobre microbeads para imunocaptura de nanocarriers (vesículas extracelulares, lipoproteínas e vírus) em um bioensaio: captura de alto rendimento, redução no tempo de incubação e maior capacidade de captura. No entanto, as nanoesferas são difíceis de "puxar para baixo" porque sua característica superparamagnética requer gradientes de campo magnético de alta nanoescala. Aqui, uma membrana eletrodepositada com marcações eletrodepositadas é mostrada para produzir um anel nano-borda superparamagnético único com múltiplas arestas ao redor dos nanoporos. Com um campo magnético externo uniforme, o monopolo e o dipolo induzidos desta junção de borda nano se combinam para produzir uma força de captura de nanoesferas 10 vezes maior. Uma suspensão nanobead densa pode ser filtrada através da membrana nanoporosa magnética (MNM) em alto rendimento com uma taxa de captura de grânulos de 99%. O rendimento de nanocarriers específicos em meios heterogêneos por nanobeads/MNM excede 80%. Reprodutibilidade, baixa perda e taxas de captura independentes de concentração também são demonstradas. Este material MNM, portanto, expande a aplicação de imunocaptura nanobead para amostras fisiológicas.

As vesículas extracelulares (EVs) e as lipoproteínas são nanopartículas biológicas que podem ser encontradas em diversos fluidos biológicos1,2,3. Sua função recentemente descoberta de entregar carga molecular entre as células catalisou uma atividade de pesquisa considerável em muitos campos4,5. Esses nanocarreadores biológicos podem ser mediadores críticos da comunicação intercelular6,7. Assim, EVs específicos, lipoproteínas e suas cargas moleculares também são potenciais biomarcadores de doenças8,9,10. No entanto, esses biomarcadores muitas vezes não são exclusivos de células doentes, mas são simplesmente superexpressos. Consequentemente, é necessária uma quantificação precisa. Devido ao seu tamanho e heterogeneidade, o isolamento de alto rendimento de EVs e lipoproteínas específicas permanece desafiador e pode introduzir viés substancial no ensaio de biomarcador11,12,13,14,15. EVs e lipoproteínas também tendem a degradar, agregar ou ser adsorvidos em muitos dispositivos16,17. Assim, o isolamento imediato e de contato curto é preferível à separação por citometria de fluxo e cromatografia, cujos processos de pré-tratamento/separação são longos e complexos. Um método de isolamento eficaz, rápido e acessível é, portanto, um pré-requisito para qualquer aplicação clínica envolvendo EVs e lipoproteínas. Os avanços nas tecnologias de captura de alto rendimento são benéficos em muitos espaços biomédicos, inclusive para a detecção de vírus ou bactérias patogênicas.

O método de isolamento de lipoproteínas e EV mais específico é a imunocaptura;18,19,20 no entanto, as tecnologias tradicionais de imunocaptura, como imunoprecipitação (IP) e cromatografia de imunoafinidade, apresentam problemas de baixo rendimento devido à saturação da sonda e perda do analito. Se os nanocarriers forem marcados com fluorescência, aqueles capturados por microesferas magnéticas podem ser classificados e quantificados por citometria de fluxo. No entanto, o processo de rotulagem e isolamento é demorado e pode exigir mais de um dia para atingir o rendimento ideal, resultando em perda significativa de nanotransportador. Seus rendimentos também são limitados pelo longo tempo de incubação (8 a 48 h) devido à baixa mobilidade das microesferas para a reação de encaixe limitada pelo transporte. Uma solução para os problemas de rendimento e tempo de incubação é usar esferas nanomagnéticas. Sua grande área de superfície por volume fornece mais locais de ligação. Seu tamanho menor leva a maior difusividade e menor tempo de incubação (~ 30 min). As esferas também podem se difundir através de uma amostra fisiológica heterogênea para capturar alvos específicos de nanopartículas que tenham mobilidade reduzida devido à complexificação ou agregação. Sua grande área de superfície por volume fornece mais sondas de ligação por um fator igual à razão dos raios microbead/nanobead (~100) para a mesma concentração de peso do talão. Este aumento no número de sondas pode levar ao esgotamento completo de todos os nanocarreadores alvo, particularmente se as sondas de anticorpos tiverem alta afinidade, proporcionando assim ordens de magnitude mais altas de rendimento de ligação de nanocarreadores.

4 ×) trapping is necessary to produce >90% yield. A magnetic film can produce a higher field penetration length than a magnetic bead due to its non-focusing (non-radial) geometry. Recently, Issadore and colleagues developed a magnetic layer-coated nanoporous membrane with improved capture yield, but multiple layers of membranes are still required for efficient bead capture22. Although the field is long-range, the field gradient is not for a planar magnetic film, except at corners. In our earlier work on electric fields at microchannels23 and nanopores24, we showed that a singular electric field with a high gradient occurs in the high-permittivity (water) side of a wedge corner of a channel or a pore if the wedge angle α of the higher permittivity phase exceeds π. This wedge singular field decays radially from the wedge tip with a power-law scaling of −(π/α) − 1 and hence also has a high-field gradient. The radial decay exponent is bound between −2 of a sphere and −3/2 of an infinitely long cylinder. This singular wedge mode is antisymmetric around the wedge and introduces a dipole in the high-permittivity phase. There is a more well-known "lightning rod" wedge singularity in near-field plasmonics25,26,27 that is symmetric around the wedge, with the singular field occurring on the low-permittivity side. It occurs when the high-permittivity side has a wedge angle that is less than π. It introduces a monopole on the low-permittivity side of the wedge. Herein, we extend this concept to magnetic fields to achieve high-yield capture of superparamagnetic beads with high throughput. We designed a multi-edge superparamagnetic NiFe nanoedge with a heterogeneous junction, whose edges sustain both a magnetic monopole and dipole around each nanopore of a nanoporous polymer membrane. This approach will significantly increase the capture yield of one membrane to 99% at a throughput of 5 mL/h for a single magnetic nanoporous membrane (MNM)./p>80% of HDL is recovered using the method, nearly doubling the recovery rate for commercial kits. We also demonstrated that MNM has a high and consistent yield and hence, can provide the necessary statistics for quantifying biomarkers carried by EVs and lipoproteins in heterogeneous physiological fluids (Fig. 1c)./p>99% of the beads were captured. The bead capture efficiency did not diminish even at a flow rate of 5 mL/h. This throughput is high enough for most extracellular vesicle immunocapture applications. Furthermore, only 13% of the beads were lost when the flow rate was increased to 10 mL/h. For membranes with 1-μm pore size, the bead capture efficiency was still >80% at 1 mL/h. In stark contrast, only 22% of beads were captured by the sputtered 450-nm membrane (Fig. 3e). For larger vesicles above 300 nm, electroplated MNM with 1μm pore size can be used at a lower flow rate or with a higher external magnetic field./p>80% of HDL was recovered using this approach. To confirm the specificity of the immunocapture and non-specific adsorption in our device, two negative controls were tested. If no antibodies were functionalized onto the nanobeads in the experiments, <10% of HDL was lost in the device, which was due to non-specific adsorption and experimental error. When antibodies (Abcam, ab139401, rabbit monoclonal to ApoB) against apolipoprotein B, the structural protein for low-density lipoproteins (LDL), were used instead of anti-ApoA-I, the loss increased to 14%. The additional 4% loss may come from the non-specific capture of HDL by anti-ApoB. In both negative controls, the non-specific capture rate of <15% is significantly lower than the specific capture rate of 80%. We benchmarked our method to a commercial immunocapture kit using their standard protocol (see Supplementary Note 5). As shown in Fig. 4c, for nanobeads, only 20% HDL was captured by the μColumn (Milyteni Biotec) because of the low bead capture efficiency of the packed column. Furthermore, for microbeads like Dynabeads™, even after 16 h of incubation, which is much longer than the standard protocol, the HDL capture efficiency does not exceed 50%. For the same incubation time of 1 h as the nanobeads, only 25% HDL was recovered (Supplementary Fig. S4), marginally >15% non-specific capture rate./p>80% of HDL particles recovered and minimal non-specific retention at less than 15%. The high and consistent yield of our system provides quantification potential for studies of EVs, lipoproteins, and other extracellular RNA carriers. We further demonstrated the performance of MNM in exosome capture, purification of HDL-enriched EV samples, and EGFR-positive EVs characterization. The direct lysis protocol in this study is applicable to a variety of downstream analyses for biomarker discovery and diagnostics, such as qRT-PCR, MS-based proteomics, sequencing, etc. For drug delivery, tissue engineering, and other applications requiring intact EVs as carriers, an EV-releasing protocol is necessary. Dissociation buffers36,37, photo-cleavable linker38, and protease-sensitive linkers39 are potential strategies to detach the EVs from the MNM. Our platform is also applicable for other molecular or virus immunocapture applications where capture efficiency and throughput are essential. In addition to the isolation of specific EVs from plasma for liquid biopsy applications (disease screening and therapy management), the MNM technology should also be useful for biomarker discovery from cell cultures, as we have demonstrated here for the DiFi sample, and also for organ-on-the-chip or organoid models35,40,41,42./p>

4 buffer changes and concentrated with 3000 Da m.w. cutoff filters (Millipore). Total protein levels were determined for each lipoprotein sample (HDL and LDL) by BCA colorimetric assays (Pierce, ThermoFisher)./p>